Sistemi di genetica inversa rapida per Nothobranchius furzeri, un organismo modello adatto per studiare l'invecchiamento dei vertebrati

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 11628 (2022) Citare questo articolo

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Il killifish turchese africano Nothobranchius furzeri (N. furzeri) è un organismo modello utile per studiare l'invecchiamento, le malattie legate all'età e la diapausa embrionale. Il knockout del gene mediato da CRISPR/Cas9 e la transgenesi mediata dal trasposone Tol2 in N. furzeri sono stati segnalati in precedenza. Tuttavia, questi metodi richiedono tempo per generare pesci knockout e transgenici. Inoltre, la tecnologia knock-in che inserisce grandi frammenti di DNA come costrutti reporter fluorescenti nel gene bersaglio in N. furzeri non è stata ancora stabilita. Qui, mostriamo che l'interruzione del singolo gene mediata da CRISPR a triplo target produce in modo efficiente l'eliminazione biallelica di tutto il corpo e consente l'esame della funzione genetica nella generazione F0. Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo per creare il reporter knock-in N. furzeri senza incrocio ottimizzando il sistema CRISPR/Cas9. Questi metodi riducono drasticamente la durata degli esperimenti e riteniamo che questi progressi accelereranno gli studi sull'invecchiamento e sullo sviluppo utilizzando N. furzeri.

Il killifish turchese africano (N. furzeri) è un modello di vertebrato emergente1,2. Può essere mantenuto in laboratorio a basso costo, simile ad altri piccoli pesci da laboratorio, come il pesce zebra e il medaka. Sono state stabilite anche alcune linee innate di N. furzeri. Tra questi, il ceppo GRZ è la linea più frequentemente utilizzata che origina da un campione raccolto nel Parco Nazionale Gona‐Re‐Zhou dello Zimbabwe3. Le larve GRZ crescono rapidamente e maturano sessualmente entro 4-5 settimane, con una durata massima di soli 3-4 mesi. Si tratta della durata di vita più breve tra le specie di vertebrati ed è utile per studiare l'invecchiamento e le malattie ad esso associate4. Inoltre, anche il processo di sviluppo dell'embrione di N. furzeri è abbastanza diverso da quello degli embrioni di pesce zebra e medaka e presenta tre caratteristiche uniche; il primo è un ciclo cellulare lento durante la scissione precoce, il secondo è la dispersione e riaggregazione cellulare prima dell'inizio della gastrulazione, e il terzo è la capacità di entrare in diapausa, uno stato di arresto facoltativo dello sviluppo. La diapausa consente all'organismo di sopravvivere a lungo termine in ambienti estremi5,6.

Per esplorare la funzione genetica, gli animali knockout e gli animali reporter transgenici che consentono la visualizzazione dei modelli di espressione genetica sono strumenti potenti. I metodi per il knockout del gene mediato da CRISPR/Cas9 e la transgenesi del reporter mediata dal trasposone Tol2 in N. furzeri sono stati precedentemente segnalati7,8. Tuttavia, questi metodi richiedono molto tempo e vaste aree di riproduzione per produrre pesci knockout e transgenici. Ad esempio, generare l'eliminazione biallelica di tutto il corpo di N. furzeri mediante il sistema CRISPR/Cas9 ha richiesto almeno due cicli di accoppiamento che richiedono altri sei mesi, perché il corpo del pesce transgenico di prima generazione è costituito da pesci di tipo selvatico, eterozigoti e una piccola percentuale di cellule mutanti bialleliche. Se le cellule mutanti contribuiscono alla linea germinale, la progenie successiva conterrà pesci etero-knockout e ulteriori incroci possono produrre pesci omo-knockout a un ritmo mendeliano. Anche la produzione mediata dal sistema Tol2 di pesci reporter fluorescenti richiede almeno un incrocio ed è difficile giudicare se il reporter può riflettere modelli di espressione genetica endogena nella generazione F0 contenente reporter. Oltre al sistema Tol2, il gene knock-in è utile anche per generare un reporter N. furzeri. Sebbene sia stata precedentemente descritta una tecnologia di knock-in genetico che inserisce frammenti di DNA di 30-50 bp nel genoma di N. furzeri per lo scambio di alcune sequenze di aminoacidi9, metodi per introdurre grandi frammenti di DNA come geni reporter fluorescenti (circa 700 bp) non sono stati stato stabilito.

In questo studio, abbiamo migliorato il metodo CRISPR/Cas9 introducendo tre RNA a guida breve (sgRNA) mirati a un singolo gene per produrre un knockout biallelico di tutto il corpo in N. furzeri nella generazione F0 con un tasso di successo quasi del 100%. Inoltre, abbiamo creato un metodo altamente efficiente per generare un reporter fluorescente che riflette i modelli di espressione genetica endogena nella generazione F0 iniettando mRNA Cas9 con sgRNA per digerire una regione genomica specifica e un plasmide donatore contenente un promotore di shock termico e un gene reporter fluorescente. Questi metodi riducono drasticamente il tempo e lo spazio necessari per gli esperimenti e speriamo che accelerino gli studi sullo sviluppo e sull'invecchiamento utilizzando N. furzeri.